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            肠黏膜屏障损伤与保护研究的分子机制综述

            发布时间:2018-06-22

              Research progress in intestinal mucosal barrier damage and protective molecular mechanism

              
              Abstract:This paper reviews the molecular mechanism of intestinal mucosal barrier damage factors, such as endotoxin and oxygen free radicals, inflammatory mediators and cytokines such as interleukin (IL) , tumor necrosis factor-α (TNF-α) , nuclear transcription factor kappa B and TOLL like receptor (TLRs) and NOD receptor pathway, HMGB1, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase (NOX) etc. The protective molecular mechanisms of intestinal mucosal barrier such as intestinal epithelial tight connexin, interleukin family, and other protective regulatory factors are introduced.
              
              Keyword:Intestinal mucosal barrier; Intestinal mucosal injury; Inflammation;
             

              
              临床上常见的影响肠黏膜屏障功能的病理因素则包括饥饿、营养不良、严重感染、烧伤、休克、严重创伤、重症胰腺炎、梗阻性黄疸、长期全肠外营养、化疗及放疗等。肠道是危重症转向MODS发展的中心器官和始动因素[1].腹腔感染是内源性感染发生率难以降低的主要原因, 而感染主要来源于肠黏膜屏障受损、肠道细菌移居所致[2].肠功能衰竭参与单器官到多器官功能衰竭的进展过程, 而肠黏膜层结构在肠道屏障中发挥着关键作用[3].无论如何, 肠道黏膜结构的破坏是肠黏膜屏障损害的基础。研究显示, 肠黏膜酸中毒、氧自由基 (reactive oxygen species, ROS) 、细胞因子和炎症介质、中性粒细胞粘附等作用, 导致肠黏膜萎缩、通透性增高及肠黏膜水肿、肠绒毛高度降低, 肠系膜血管收缩、血流量减少, 细胞凋亡加速, 造成肠黏膜屏障破坏, 导致肠功能障碍。为防治肠黏膜功能损伤, 学者们针对其保护也开展了大量研究, 本文就肠黏膜屏障损伤与保护研究的分子机制研究现状作一综述。
              
              一、肠黏膜屏障损伤机制相关因子
              
              (一) 内毒素及氧自由基
              
              研究显示, 外科危重症如重症胰腺炎、缺血缺氧再灌注损伤等系统性炎症性疾病发生时, 主要器官如胰腺、肠道、肺部等发生一系列组织血流和微循环紊乱、氧化应激, 大量氧自由基 (oxygen free radical, OFR) 和炎症因子如花生四烯酸代谢产物血栓素A2 (thrmboxane A2, TXA2) 、前列环素 (prostacyclin, PGI2) 、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 、血小板活化因子 (platelet activating factor, PAF) 、磷脂酶A2 (phospholipase A2, PLA2) 、一氧化氮 (nitric oxide, NO) 等、血管活性物质、毒素等产生、释放入血, 形成不可控性的“炎性瀑布”, 导致相应靶器官、靶组织和靶细胞的病理、组织、生理学的改变[4].
              
              (二) 炎症介质和细胞因子
              
              目前认为发生重症急性胰腺炎、缺血缺氧再灌注损伤等炎症疾病时, 参与其系统性炎症进展过程有关的细胞因子主要有白细胞介素-1 (interleukin-1, IL-1) 、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6) 、白细胞介素-8 (interleukin-8, IL-8) 、白细胞介素-10 (interleukin-10, IL-10) 和TNF-α等。IL-1、IL-6、IL-8作为促炎因子, 可作用于白细胞、中性粒细胞, 使其激活或释放溶酶体酶、超氧化物等, 促进炎症进展。IL-10作为抗炎介质, 抑制巨噬细胞功能, 如TNF-α、IL-1的产生和ROS的释放。TNF-α和IL-6则参与了肠道渗透性的功能改变[5].这些炎症介质损伤了细胞核酸、蛋白质、脂质等, 导致细胞功能障碍、细胞凋亡, 使肠黏膜损伤加重, 引起肠黏膜屏障功能损害。
              
              (三) 核转录因子kappa B
              
              核转录因子kappa B (nuclear transtription factor kappa B, NF-κB) 是一个转录因子蛋白家族, 为一类能与多种基因的启动子或增强子κB位点发生特异性结合并启动基因转录的蛋白质, 包括5个亚单位:Rel (c Rel) 、p65 (Rel A, NF-κB3) 、Rel B、p50 (NF-κB1) 和p52 (NF-κB2) .NF-κB与活化蛋白-1等转录因子共同起着中心调节作用。NF-κB的活化是炎性反应早期启动的关键步骤。NF-κB可在转录水平调控TNF-α、IL- (1β、2、6、8、12) 、诱导型一氧化氮合酶 (inducible Nitric Oxide Synthase, i NOS) 、环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX2) 、趋化因子、粘附分子 (细胞间黏附分子-1, E-选择素, 血管细胞粘附分子) 、集落刺激因子等多种炎症介质的基因表达。NF-κB被TNF-a、IL-l特异性受体激活后, 可刺激TNF-α、IL-l的产生。这些炎症因子的增多又促进NF-κB的活化[6].NF-κB参与炎症反应的病理生理过程, 在其早期局部炎性反应、各种并发症均起到关键作用。NF-κB在重症胰腺炎及其相关性肺损伤、肝损伤、肠黏膜损伤过程中也发挥着重要作用。
              
              (四) TOLL样受体 (TLRs) 和NOD受体通路
              
              哺乳类动物天然免疫是机体抵抗生物入侵的第一道屏障, 主要通过模式识别受体识别病原体实现的, 包括TOLL样受体和NOD受体。TOLL样受体是一种跨膜信号转导蛋白, 其信号转导通路、免疫调节已受到广泛研究, 已发现TLRs13种, 人类中10种。TLRs能够诱导NF-κB激活, 启动受NF-κB调控的炎症因子如IL-6、IL-18等基因转录, 介导和参与一系列免疫和炎症反应。TOLR2主要识别革兰阳性菌、分支菌种属、细菌脂蛋白等, 在急慢性感染中发挥重要作用。TOLR2能和TOLR 1或TOLR 6结合成异质二聚体识别病原体。TOLR4则主要参与脂多糖 (革兰阴性菌细胞壁成分) 、类脂A、热休克蛋白60等信号转导成果, 是宿主识别革兰阴性菌感染的主要途径之一。TOLR4识别的鞭毛蛋白是革兰阳性菌和革兰阴性菌结构中的必要蛋白组成成分。TOLR 3、7、8、9则表达在细胞内, 主要监测和识别病毒核酸。
              
              近年发现的NOD受体蛋白在介导炎症反应或细胞凋亡信号通路中的重要作用受到较大关注。目前发现NODs蛋白家族成员包括Apaf-I (apoptotie protease activating factor 1) 、NODl (CARD4) 和NOD2 (CARDl5) .NOD2可通过信号传导途径激活一系列炎性细胞因子如TNF-a、IL-6、IL-1等基因的转录, 继而大量表达介导炎症反应, 如阻塞性黄疸、肺部损伤等。NOD2还可通过促进caspases激活, 诱导和加强细胞凋亡[7].NOD2的基因突变往往导致重要的病理生理改变, 如克罗恩病、自身免疫性胰腺炎等。临床调查显示NOD2/CARD15基因变异的脓毒症具有更高的死亡率, 推测在脓毒症病人早期NOD2/CARD15基因变异导致肠黏膜屏障功能受损[8].最近有学者发现在大鼠急性胰腺炎炎症进展过程中, NOD2在激活胰腺组织NF-κB活化和上调方面发挥重要作用[9].NOD2可能通过诱导NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 及半胱氨酸--门冬氨酸特异蛋白酶 (caspases) 激活、促进细胞防御素表达等, 介导炎症反应或细胞凋亡信号通路的激活[22-24].
              
              (五) 高迁移率族蛋白B1
              
              高迁移率族蛋白 (high mobility group protein, HMG) , 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力, 是一大类富含电荷的低分子非组蛋白染色体核蛋白, 高迁移率族蛋白B1 (high mobility group box1 protein, HMGB1) 是其成员之一, HMGB1参与DNA的复制、转录和修饰。1999年首次报道HMGB1作为潜在的晚期炎症介质参与脓毒症的发病过程, 是内毒素致死效应的晚期重要炎症介质。内皮细胞、巨噬细胞是胞外HMGB1主动分泌方式产生的主要来源。HMGB1也可由坏死细胞被动释放, 是坏死组织激发炎症反应的主要因子。HMGB1与晚期糖基化终产物受体 (receptor for advanced glycation endproducts, RAGE) 及Toll样受体 (TLRs) 相结合[10], 从而激活下游炎症通路, 参与炎症病情进展。2012年张等[11]研究认为, 血清HMGB1含量可反映急性胰腺炎病情严重程度, 并可作为判断其肠黏膜屏障损伤的参考指标。热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70) 能够负性调节HMGB1的表达[12], 从而减轻炎症反应。
              
              (六) NADPH氧化酶
              
              NOX2在组织中的表达也最为广泛, 尤其在胸腺、小肠、结肠、脾脏、胰腺、卵巢、睾丸、胎盘的吞噬细胞中。此外, 在神经元、心肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞及造血细胞等非吞噬细胞中, NOX2也存在着较广泛的表达。研究表明, NADPH氧化酶在氧化应激、炎症反应、细胞凋亡通路中均发挥重要作用。YU等[13]在蛙皮素诱导的胰腺炎腺泡细胞AR42J中发现, NADPH氧化酶亚基激活介导了NF-κB炎症通路激活及IL-6表达, 认为NADPH氧化酶通过介导激活NF-κB炎症通路参与了炎症因子的表达;NADPH氧化酶可能通过上调凋亡诱导因子, 参与蛙皮素诱导的胰腺炎腺泡细胞的凋亡过程[13].NADPH氧化酶抑制剂DPI可有效抑制其凋亡[14].在胰腺炎小鼠实验中, NADPH氧化酶介导了胰内消化蛋白酶的激活过程[15].近几年研究显示, 在脑缺血再灌注损伤[16]、脓毒症[17]、急性呼吸窘迫综合症及心脏氧化应激等炎症反应中, NADPH氧化酶发挥重要的关键作用。炎症反应时, NADPH氧化酶家族发生“氧化爆发”产生大量ROS参与信号转导、免疫功能、激素生物合成, 构成机体抵抗病原体的第一防线。gp91phox (NOX2) 是NADPH氧化酶主要的功能亚基, 其表达与氧化应激发生相关[18].
              
              二、肠黏膜保护机制相关因子
              
              (一) 肠上皮紧密连接蛋白
              
              紧密连接 (tight junction, TJ) 是维持肠黏膜上皮细胞间机械屏障的重要结构基础, 一类为细胞膜结构蛋白, 如Claudins蛋白、occludin蛋白、连接黏附分子 (junction adherensive molecular, JAM) 及CAR (cosackie virus and adenovirus receptor) ;一类为细胞质蛋白, 能与多种蛋白质结合, 起连接或信号传递作用, 多数含PDZ结构域, 包含ZO蛋白 (Zonula occludens, ZO-1, ZO-2, ZO-3) 、MAGI蛋白 (1, 2, 3) 、MUPP1、ASIP/PAR-3及PATJ等。其功能是调节细胞间物质转运, 允许离子和小分子可溶性物质通过, 而不允许微生物及有毒大分子通过, 并且相关蛋白分子还参与细胞增殖分化、基因转录等过程的信息传递和调控, 其在肠道屏障功能中地位极为重要。
              
              国内研究表明, 大鼠回肠组织中ZO-1表达下调是SAP肠黏膜屏障损伤的重要原因之一, 可能与炎性细胞因子TNF-α的过度释放及DAO活性降低有关。TNF-α可下调肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1的表达。促肾上腺皮质激素释放因子 (corticotrophin-releasingfactor, CRF) 对肠上皮细胞中Ncldn2表达刺激呈剂量依赖效应, 并且CRF对肠上皮细胞的这种诱导作用可能与NF-κB激活有关。
              
              (二) 细胞外热休克蛋白 (extracellular heat shock protein, e HSP)
              
              热休克蛋白 (heat shock protein, HSP) 是细胞受热等因素刺激后诱导产生的蛋白质, 是在生物进化中高度保守的蛋白质分子家族, 广泛存在于从原核到真核各种生物细胞内。HSP在正常生理条件下起重要作用, 作为分子伴侣参与未折叠新生多肽链、多蛋白复合物的组装和跨膜运输、转位、蛋白质降解, 细胞内蛋白质合成后的加工等一系列生物活动, 保护细胞生存。Hsp70是HSP家族中最重要的一员, 诱导性显着, 合成量较多。HSP转录上调减少炎症、氧化和细胞凋亡, 保护细胞因子和组织, 通过伴侣功能促进应激细胞的活力[19].HSP70作为细胞内保护者, 在胃肠黏膜对抗细胞毒素和细胞应激中发挥“分子伴侣”功能, e HSP70具备免疫系统的“危险信号”免疫调节功能[20].在胃黏膜中细胞内HSP70在毒素物质致溃疡形成的机制方面发挥保护作用。胃黏膜损伤和肠黏膜损伤中, 细胞内HSP70具保护作用。研究显示[21], 大鼠严重烫伤后肠道中e HSP70和IL-2的表达均降低, 且两者呈明显正相关。e HSP70可体外促进严重烫伤大鼠肠道派伊尔结中CD3+T淋巴细胞向Th1方向分化, 明显降低其凋亡率, 促进其释放IL-2.在外围组织创伤 (pseudofracture-model, PF) 模型和出血性休克再灌注模型中, HSP70的过表达可上调抗炎通路、而抑制炎症反应, 从而减轻肠道内皮损伤以及减轻肝损伤[22-23].
              
              (三) 白介素家族
              
              目前至少发现了38个白介素, 它们在生物学上许多具有双向调节功能。IL-3, 4, 10, 11等在肠道中具有抑制炎症、保护肠黏膜屏障的作用。IL-3是粘膜肥大细胞增生的调节因子, 也有促进小肠隐窝细胞增生的作用。IL-4在肠道中主要是抑制炎症作用, 可抑制单核细胞产生TNF-α、IL-1β。大量文献认为IL-4与肠道炎症失衡呈现相关性。IL-11具有肠道保护和肠损伤修复作用。研究显示rh IL-11在 (放化疗的肠损伤、短肠综合征以及炎症性肠病的治疗中发挥重要作用。IL-11可以抑制肠黏膜细胞凋亡、提高肠隐窝干细胞的有丝分裂活性, 从而对放化疗的肠损伤发挥保护作用。IL-11可促使肠黏膜细胞增殖、增大肠黏膜细胞面积, 增强肠吸收功能。rh IL-11抑制前炎性因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ等产生, 调控免疫和急性应答, 促进黏膜修复。其机制与IL-11下调Caspase-3与Bax表达, 上调Bcl-2、PCNA的表达有关[24].IL-10超家族在肠道中是重要的抑制炎性因子, 白细胞介素22 (IL-22) 是IL-10家族成员之一。在不同的炎症反应中, IL-22具有促进炎症病理作用, 又具有抑制炎症修复组织创伤的看似“矛盾”的双重作用, 但其机制复杂;在肠道生物学表现中, 它促进抗菌肽的分泌、引起结肠黏蛋白表达增强粘液屏障、促进肠上皮再生等作用[25].张新艳等[26]研究显示, IL-22的动态表达对于肠上皮的损伤修复起到十分关键的作用;利用基因编辑技术构建了Il-22ra1基因敲除小鼠, 发现KO小鼠在DSS诱导的IBD模型中表现出更剧烈的炎症反应, 且恢复更慢, 说明在动物体内IL-22通过其受体对肠损伤修复发挥保护功能。
              
              (四) 其它保护性调控因子
              
              血栓调节蛋白 (thrombomodulin, TM) 主要由血管内皮细胞分泌, 通过结合HMGB1, 激活蛋白C, 降低凝血酶的活性而发挥抗炎、抗凝的活性。并且, 热休克转录上调TM的表达[19].CD24在Siglec10的参与下与HMGB1结合、阻断NF-κB活化, 抑制炎性因子释放, 被认为是HMGB1天然的负性调控受体[27].在炎症性肠病中, CD24可能由Wnt信号调节, 赋予增强的集落形成能力和增强细胞的运动功能, 促进结肠黏膜组织的愈合[28].
              
              肠内营养、谷氨酰胺、生长激素、表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF) 、胰高血糖素样肽-2 (glucagon-like peptide 2, GLP-2) 等均可维持肠道功能, 诱导肠上皮细胞增生, 增加小肠DNA、RNA及蛋白质含量, 促进结肠黏膜的增生[29].其它如中医中药, 及肠道有益微生物补充、“粪便移植”, 也是目前研究的热点方向。
              
              总体而言, 肠道黏膜包含机械、生物、化学、免疫四道屏障, 肠黏膜屏障损伤往往是不同机制相互影响、相互作用的。揭示肠黏膜屏障的分子损伤与保护机制, 对肠黏膜屏障的基础与临床研究意义重大。

              参考文献

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